新型活性饲用微生物添加剂研制及生物活性评价

【摘要】微生物制剂以其无毒、无残留、无耐药性及低成本、可有效补充消化道有益微生物等诸多优点,成为替代抗生素的理想制品之一,而被广泛应用。本文从仔猪的粪便中分离鉴定的益生菌-蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus),又外购了2个益生菌：鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnose)、戊糖乳杆菌(lactobacilluspentose)。以这3株细菌为研究对象,对3株益生菌分别进行培养和发酵条件优化,以期用廉价培养基成分获得到较高的活菌数；然后对3株益生菌的稳定性、抗逆性、菌种间的最佳配比及制得的微生物制剂的饲料酶活性进行研究,研究了复合微生物制剂对断奶仔猪生产性能、肠道定植和肠道菌群等的影响。获得如下研究结果：从待分离样品中,经分离、纯化,生理生化鉴定和16SrDNA测序分析,分离到一株肠道益生菌-蜡样芽孢杆菌。经过安全性检验可知,该菌株安全、无毒副作用,可作为制备微生物制剂的备用菌株。采用单因素试验及正交试验的方法对分离筛选到的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)及外购的鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnose)、戊糖乳杆菌(lactobacilluspentose)分别进行培养基组成和培养条件优化,获得lactobacilluspentose最佳培养基配方为0.5%乳糖+0.5%废糖蜜,0.5%棉粕粉,0.15%磷酸二氢钠+0.15%磷酸氢二钠；Bacilluscereus最佳培养基配方为0.5%蔗糖+0.5%废糖蜜,1%棉粕粉,0.1%氯化钠；鼠李糖乳杆菌的最佳培养基配方为0.5%乳糖+0.5%废糖蜜,0.5%棉粕粉,0.3%磷酸二氢钠+磷酸氢二钠。最优发酵条件,即lactobacillusrhamnose最佳发酵条件为：发酵时间24h,起始pH为6.5,温度为35℃,接种量5%,装液量20%；蜡样芽孢杆菌最佳发酵条件为：发酵时间28h,起始pH为7.5,温度37℃,接种量7%,装液量40%；鼠李糖乳杆菌最佳发酵条件为：发酵时间28h,起始pH为7.0,温度37℃,接种量7%,装液量40%。最后,以各自优化后的最佳培养基配方和发酵条件,活菌数分别达1.32×109cfu/ml、1.15×109cfu/ml和166×109cfu/ml。对3株益生菌的耐热性、肠道耐受性及贮存稳定性进行研究。结果表明,在65℃的条件下,蜡样芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和戊糖乳杆菌的存活率分别为92.54%、90.43%和87.01%,说明3株益生菌均具有较好的耐高温性质。体外模拟动物肠道耐受性试验结果显示,3株益生菌均能在pH为1.5的胃液中处理3h后保持106活性以上达,说明3株益生菌均能够在正常仔猪胃肠道中耐受较低pH；并且,3株益生菌均能在胰蛋白酶溶液处理3h后维持活菌数为108,在0.40%的胆汁溶液中维持活菌数在106以上,说明,3株益生菌均能够耐受胰蛋白酶溶液和胰蛋白酶溶液等消化酶的作用,完全可以耐受仔猪的胃液并进入小肠发挥益生作用。贮存稳定性试验结果表明,加有保护剂(5%葡萄糖溶液)、-7℃(冷冻)条件下贮存的菌粉稳定性明显高于其他组,90d后活菌数量仍保持在109cfu/g水平。通过急性毒理试验表明,以1;1:1比例混合的3株益生菌对小鼠一般体征、行为、活动、毛发、色泽、饮食、粪便均未有明显不良反应,小鼠未出现死亡现象；各组体重持续增长,与对照组相比,试验组体重变化无显著性差异(P>0.05)；肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数无显著性变化,可初步判定混合益生菌无毒性。通过将1：1：1混合的3株益生菌分别与大肠杆菌(Escherichiacoli)和沙门氏菌(salmonella)共培养,并采用3株接种时间(益生菌与有害菌同时接种、先接种益生菌后接种有害菌和先接种有害菌再接种益生菌)来验证3株益生菌对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌能力,结果表明,混合益生菌在三个接种时间均具有一定的抑菌效果。但混合益生菌先24h接种的效果要明显好的多。而晚24h接种,仍然具有一定的拮抗效果,只是拮抗的时间要到48h效果明显。并且,进一步研究混合益生菌发酵液、发酵滤液和菌体悬液抑菌功效表明,混合益生菌发酵液、发酵滤液和菌体悬液均可抑菌大肠杆菌和沙门氏菌,并且发酵液和发酵滤液的抑菌效果明显优于菌体悬液。以1：1：1、1：2：1、2：1：2、1：1：2(依次为蜡样芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和戊糖乳杆菌)的比例混合3株益生菌,制得4种混合微生物制剂饲喂断奶仔猪,研究各微生物制剂对仔猪生长性能的影响。结果表明,饲粮中添加1：1：1的比例混合的微生态活菌制剂,在提高仔猪的生长性能效果最显著,并显著降低了腹泻率。并且,添加混合微生态菌制剂的试验组与对照组相比,试验组的粗蛋白质、粗脂肪、钙和磷均有提高,并且,每头猪的经济效益还提升了16.194元。对3株益生菌的产饲料酶-蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和β-甘露聚糖酶进行了定性检测。再以此为依据,对3株益生菌和1：1：1的比例混合的微生物制剂的产酶活性做了进一步研究。结果表明,蜡样芽孢杆菌的蛋白酶和淀粉酶的活性最高分别达到70.52U/ml和25.47U/ml,且只有蜡样芽孢杆菌具有产甘露聚糖酶能力,酶活力为5.35U/ml；鼠李糖乳杆菌的纤维素酶活性最高,达4.06U/ml。将3株益生菌混合制成的微生物制剂,制剂具有4种饲料酶的活性,虽然4种饲料酶活力均未达到单一菌株能够达到的最高值,但各饲料酶均能检测到活性,且活力较高,蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和甘露聚糖酶分别达到62.35U/ml、21.67U/ml、3.83U/ml和5.21U/ml。应用Real-timePCR方法准确地对试验期间仔猪粪便标本中的3株特定益生菌进行定量检测。结果表明,喂食微生物制剂期间(28天),试验组中3株益生菌的数量多高于对照组(P<0.05)；在停喂微生物制剂两周后,于42天时试验组仔猪粪样中检测出3株益生菌存在,且3株益生菌数量均超过断奶当日水平,表明3株益生菌均已定植在仔猪肠道内。试验期间粪样的pH研究表明,在对照组中,由于断奶的影响,仔猪粪便pH呈现先上升后下降趋势,直到35d后才逐渐恢复；试验组仔猪粪样pH始终较对照组低,且基本保持在断奶水平。说明通过饲喂微生物制剂仔猪消化道保持偏酸性环境,可利于有益微生物的生长和定植。利用DGGE技术对断奶仔猪粪样中微生物菌群进行跟踪研究。结果显示,饲喂微生物制剂可以通过在仔猪消化道内定植来促进肠道益生菌(双歧杆菌、嗜酸乳杆菌)的生长繁殖,抑制有害菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌)的生长,从而达到调节肠道菌群的效果。并且,相似性结果显示,对照组中,断奶0和7d之间相似性最低,为38%,以后逐渐增加,7和28d间相似性为50%；而试验组仔猪断奶0和7d相似性达67%,以后相似性迅速降低,7和28d间相似性为50%；多样性结果显示,实验期内试验组多样性多高于对照组,并且在整个试验期间保持相对稳定,说明断奶后日粮中添加微生物制剂使仔猪肠道菌群趋向复杂化、多样化,试验组仔猪粪样菌群的相似性、多样性均高于对照组。
【作者】王娜；
【导师】赵敏；
【作者基本信息】东北林业大学，微生物学，2014，博士
【关键词】蜡样芽孢杆菌；鼠李糖乳杆菌；戊糖乳杆菌；定植；DGGE；

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